Agrobacterium tumefaciens merupakan vektor yang dapat mentransfer gen asing ke dalam tanaman. Secara umum, mekanisme proses transformasi gen oleh Agrobacterium adalah dengan menempel pada sel tanaman yang telah dilukai. Agrobacterium akan mengenalkan Ti plasmid, bagian T-DNA (transferred DNA) ke dalam inti sel tanaman. Salah satu tanda keberhasilan transformasi gen adalah pembentukan tumor pada tanaman, yang merupakan respon onkogenik. Gen-gen onc ini akan mengkode biosintesis auksin dan sitokinin, kemudian merangsang proliferasi sel menjadi sel kalus tumor (crown gall).

skema transfer gen

Skema Transfer T-DNA ke inti sel tanaman (Tzfira dan Citorsky, 2006)

Berdasarkan ilustrasi di atas, Agrobacterium memiliki Ti plasmid yang memiliki komponen transfer T-DNA, gen vir dan gen untuk katabolisme opin. Gen vir terdiri dari VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirG, VirF dan VirH. Senyawa-senyawa fenolik yang dihasilkan dari pelukaan tanaman akan menginduksi transkripsi sederetan gen vir  dan berakhir dengan penyisipan gen-gen yang ada pada daerah T-DNA. virA yang merupakan protein kinase untuk mengaktifkan virG dan memfosforilasinya menjadi virG-P. Dengan aktifnya virG-P ini akan mengaktifkan gen-gen vir lainnya untuk mulai bersifat virulen dan melakukan transfer VirD untuk memotong situs spesifik pada Ti plasmid, pada LB dan RB sehingga melepaskan T-DNA yang akan ditransfer dari bakteri ke sel tanaman. T-DNA utas tunggal akan diikat oleh protein VirE yang merupakan single strand binding protein sehingga terlindung dari degradasi. Bersamaan dengan itu, protein virB membentuk saluran transmembran yang menghubungkan sel A. tumefaciens dan sel tanaman sehingga T-DNA dapat masuk ke sel tanaman. T-DNA membawa gen biosintetik enzim untuk menghasilkan asam amino octopin dan nopalin Dalam T-DNA juga terdapat gen iaaHiaaM, dan ipt untuk menyandikan enzim-enzim penting dalam biosintesis tanaman yaitu auksin dan sitokinin (De la riva et al, 1998). Dengan mengubah keseimbangan hormon dalam sel tanaman tersebut bagian sel yang terinfeksi menjadi tidak dapat terkontrol oleh tanaman dan terjadi pembentukan tumor.

Pada prinsipnya, transformasi gen menggunakan vektor Agrobacterium dilakukan pada tanaman berjenis dikotil karena jenis-jenis tanaman tersebut merupakan host range dari Ti plasmid. Akan tetapi, penelitian mengembangkan modifikasi transformasi gen oleh Agrobacterium pada tanaman monokotil dengan dasar: akumulasi pembentukan tumor, produksi opin, hormon pertumbuhan autonom tumor, dan keberadaan T-DNA.

Berikut beberapa perbedaan transformasi gen oleh Agrobacterium tumifaciens pada tanaman dikotil dan monokotil.

Aktivasi Gen Vir Oleh Senyawa Fenolik

Pada tanaman dikotil, Agrobacterium menempel pada tanaman yang terluka karena tanaman tersebut mengelurkan molekul sinyal berupa senyawa-senyawa fenolik, seperti acetosyringone dan a-hydroxyacetosyringone. Senyawa-senyawa fenolik ini akan mengaktifkan gen vir yang terdapat di dalam Ti plasmid, yang bertanggungjawab untuk mentransfer T-DNA dari Agrobacterium tumifaciens menuju sel inangnya (tanaman). Molekul-molekul fenolik lain yang berperan megaktifkan lokus vir antara lain: catechol, gallic acid, pyrogallic acid, p-hydroxybenzoic aid, protocatechuic acid, [~-resorcylic acid, and vanillin.

Pada tanaman monokotil, senyawa-senyawa fenolik ini tidak dihasilkan atau jumlahnya sangat sedikit sehingga dapat memblokade infeksi oleh A Tumefaciens. Dengan demikian, beberapa strategi transformasi gen pada tanaman monokotil adalah dengan homogenisasi jaringan tanaman dan menambahkan senyawa-senyawa fenolik pada medium A Tumefaciens sebelum transformasi dilakukan untuk aktivasi gen-gen vir dalam Ti Plasmid.

Penempelan A Faciens Dengan Tanaman Target Dan Pembentukan Tumor

Penempelan A Faciens pada tanaman dikotil dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain umur jaringan/tanaman, tipe sel, tahapan siklus sel, dan parameter fisiologis lain. Pada tanaman dikotil, senyawa-senyawa fenolik akan merangsang A tumifaciens untuk menempel dan mentransfer T-DNA.

Sebagian besar tanaman monokotil tidak membentuk tumor sebagai hasil infeksi A. tumefaciens. Hal ini karena Agrobaktrium tidak menempel pada sel monokotil berdasarkan minimnya area penempelan pada tanaman monokotil. Penelitian mengembangkan strategi yaitu menggunakan sel meristem pada proses trasnformasi gen menggunakan agrobakterium. Kelebihan menggunakan sel meristem tanaman monokotil pada transformasi gen antara lain:

  • i) v/r-inducing substances are produced by embryonic tissues
  • (ii) low production of bacteriotoxic substances
  • (iii) favorable endogenous hormone levels
  • (iv) availabilityof receptors for attachment of Agrobacterium (Chen et al., 1993)
  • (v) these cells are actively dividing and host DNA synthesis is occuring. DNA synthesis may be required for T-DNA integration

Strategi pembentukan tumor pada tanaman monokotil adalah dengan penambahan promoter untuk meningkatkan ekspresi gen-gen pembentuk tumor.

Penggunaan Strain A. Tumifaciens Dengan Rentang Inang Yang Luas (Wide Host Range)

Pada transformasi gen ke dalam tanaman dikotil, strain A tumifaciens umumnya dapat digunakan karena gen-gen Vir yang terdapat dalam Ti plasmid sudah memenuhi ketentuan transformasi. Akan tetapi, untuk transformasi gen ke dalam tanaman monokotil, dibutuhkan strain a tumifaciens dengan rentang inang yang luas dan plasmid yang sesuai.

There are currently no comments.